ELISA主要材料试剂（下）
ELISA实验中对所使用的酶也有所要求，主要为纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格便宜、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，与抗体或抗原偶联后需继续保留着它的活性部分和催化能力。在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。此外，酶的底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收度高。ELISA中最常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP）。
除HRP和AP以外，可应用于ELISA试剂中的酶还有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。如β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可使用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为 pH9.6的碳酸盐缓冲液）中，加至ELISA板孔中在4℃过夜孵育，经清洗后即可使用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面未能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的待测样品中的蛋白也会吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。
在这种情况下，可在包被后的Elisa板中用1％～5％牛血清白蛋白(BSA)再包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的ELISA板在低温(2~8℃)放置一段时间而不失其免疫活性。
酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，则可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。
①戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，酶和抗体中的氨基可通过该试剂进行偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。偶联方法为：2～5 mg纯抗体与5 mg AP混合于1ml 0.1mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液中，并用此磷酸盐缓冲液对该酶和抗体混合液于4℃下透析平衡。磁力搅拌下，向酶和抗体溶液中缓慢加入1％戊二醛0.05 ml，在室温下放置2小时。在4℃下使用50mM pH8.0 Tris缓冲液对偶联后的酶和抗体溶液透析平衡，即得酶标抗体。
辣根过氧化物酶可溶解于50％饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50％饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。
②过碘酸盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18％碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。
